본 글은 다음 논문에 대하여 정리한 글입니다.
Golding, C. G., Lamboo, L. L., Beniac, D. R., & Booth, T. F. (2016). The scanning electron microscope in microbiology and diagnosis of infectious disease. Scientific reports, 6(1), 1-8.
3줄 요약
1. 금속 코팅된 Polycarbonate 필터 준비, SEM 이미지화를 위한 Ionic Liquid 샘플 준비를 읽고 세균이나 바이러스 시료를 준비하자.
2. 이렇게 하면 탈수하지 않아도 되므로 관찰 대상의 자연 상태에 가까운 이미지를 얻을 수 있다.
3. 기존의 이미지는 탈수로 인한 왜곡이 있을 수 있으므로 엄밀한 재분석이 필요할 것이다.
초기 연구에서 전자 현미경은 감염병의 원인 물질을 식별하는데 중요한 역할을 하였다. 전자 현미경은 병원균을 진단하고 미생물을 식별하는데 사용되는 아직도 중요한 기술이다.[1] 전통적으로 negative staining을 적용한 TEM (투과 전자 현미경)은 바이러스 진단학 등 미생물 샘플의 이미지화의 "golden standard"였다.[2] 그러나 negative staining을 적용한 TEM은 얇은 support film에 분자가 흡착되어야하기 때문에 충분한 농도의 세균 입자나 바이러스 입자가 필요하다. 따라서 미생물들은 높은 피로도에서 자라야 하거나, 또는 동시에 원심분리를 통하여 농축되어야 하는데 이들은 환자의 시료나 (patient specimen) 배양 불가능한 것들에서는 보통 불가능하다. 결과적으로 전자 현미경 관찰법은 역사적으로 많은 유형의 미생물 검사에 있어 낮은 민감도로 어려움을 겪어왔다. 환자의 시료에서 poxvirus나 polyoma virus를 TEM으로 발견하기 위해서는 최소한 $10^5$~10^6$ 입자/ml의 농도가 필요하다. 비교적으로 배양액이나 핵산 시험법으로 바이러스를 발견하는 것은 1~50 입자/assay 정도를 필요로 한다. 최근 여과 기법의 발전은 TEM과 SEM으로 바이러스를 확인하는 것이 샘플당 5000 입자로 가능하다는 것을 보여준다.[3] 더욱이 전자 현미경 관찰법은 현재 존재하는 미생물의 유형을 속의 범주까지 알아내는데 유용하며 이는 존재하는 물질을 정확하게 식별하여 더 특징적인 시험법을 고를 수 있도록 해준다 (예를 들어 프라이머나 특징적인 항체). 따라서 전자 현미경 관찰법은 새로운, 또는 부상하는 병원균이 사전의 지식 없이 조사될 때 "열린 시야"를 제공하는 이상적인 "모두 잡기" 방법이다.
SEM (주사 전자 현미경)은 진단 뿐만 아니라 분리된 생물의 형태학적 특징을 알아내는데 유용하게 쓰일 수 있으나 시료 준비 방법에 있어 어려움이 SEM이 미생물학에서 일상적으로 사용되는 것을 제한하였다.[3][4] 오늘날에는 극도로 높은 품질의 polycarbonate 필터를 얻을 수 있다. 이 필터에서는 최적의 pore 크기가 모든 종류의 바이러스나 세균 종을 선별할 때 사용할 수 있다 (pore는 최대 10nm까지 작아질 수 있으며 이는 바이러스보다 작은 크기이다). 이 필터는 바이러스와 세균의 표면을 SEM으로 관찰하는데 매우 적합하다. 고해상도 SEM 미생물 이미지를 얻는데 크게 두 가지의 문제점이 있다. 첫째로 적절한 대비를 얻고 1000x 이상의 배율에서 세균이나 바이러스와 같은 작은 유기 분자의 charging을 줄이기 위하여 conducting surface가 필요하다. 둘째로 생물학적 시료는 SEM에서 최고의 이미징 성능을 위하여 전통적으로 탈수될 필요가 있었다. 만약 탈수되지 않은 시료가 현미경 안에 들어가면 강한 진공 상태에서의 작동이 시료를 급격히 건조시킬 것이다. 이 두 요인 모두 현미경의 성능을 저하시키고 대비와 해상도를 감소시킬 수 있다. SEM 관찰에 있어 건조는 문제점이며 주로 시료의 붕괴, 수축, 왜곡을 일으킨다 (심지어 화학적 고정에 의한 보존 이후에도 일어난다). 이전에는 SEM 관찰 전에 시료를 탈수시키기 위하여 용액을 사용하는 방법 (가끔씩은 임계점 건조 (critical point drying)나 동결 건조 (freeze drying)와 함께 사용)등 다양한 방법이 개발되어왔다. 대안적으로 물을 포함한 상태의 샘플을 이미지화하기 위한 방법이 사용되어 왔으며 "wet-SEM"[3][5][6][7], environmental SEM[8], cryo-technique[9][10]을 이용해왔다. 임계점 건조는 생물학적 시료의 cunductive coating를 가능하게 해주면서 charging이 감소하였고 대비가 개선되었지만 인위적인 균열이 생기며 50% 가까이 수축하였으며 동결 건조에서는 얼음 결정 형성으로 인한 변형과 손상이 자주 발생했다.[11] 플래시 동결 (Flash freezing) 또는 고압 동결 (high pressure freezing)이 생물학적 시료에 얼음 결정 형성을 줄이기 위하여 자주 사용된다. SEM 관찰 이전에 동결 함수 샘플은 냉동-절편화 (cryo-sectioned)되거나 냉동장 (cryo-stage)에 장착될 수 있다. 이 경우 case ion beam milling이 내부 구조를 조사하기 위하여 사용될 수 있다. [9][10] 이 기술의 발전된 변형인 cryo-TEM 역시 동결-유리화된 (frozen-vitrified) 샘플을 TEM으로 조사할 때 사용할 수 있다. Cryo-TEM 기술에서는 시료가 비정형 상태 (amophous state)를 유지하고 얼음 결정 손상을 피하기 위하여 -150℃ 이하의 온도에서 유지되어야 한다. Cryo-TEM은 바이러스를 포함한 고분자 구조를 조사하는 데는 가장 알맞지만 cryo-SEM은 상대적으로 좁은 시야를 제공하고 높은 농도의 바이러스를 필요로 하며 (~1mg/ml) 대부분의 세균은 얼음층에서 고해상도 TEM 이미지를 얻기에는 너무 두꺼워 세부 사항을 알기 힘들 수도 있다.[12][13][14] 전문화된 "wet-SEM" 이나 "wet-TEM" 시료 홀더도 완전 함수 시료를 이미지화하기 위하여 개발되었지만 이들은 고도로 전문화된 장비를 필요로 하며 scanning-transmission (STEM) 모드에서 작동하기 때문에 SEM과 직접 비교할 수 없다. 이 홀더는 하나 또는 두 전자-투과 창 (electron-transparent window)을 통하여 진공에서 분리된 액체 챔버 (liquid chamber)나 유동성 액체 (fluid liquid)가 있다. 이 경우 전자 빔이 고체 창 (solid window)을 통과하여 진행하기 때문에 시료 표면이 직접 조명되는 SEM에 비해 해상도가 저해된다.[5][6][7] 물기가 있는 샘플을 이미지화하기 위한 또다른 접근은 environmental SEM (ESEM)으로 차등 펌핑이 시료 주위의 압력을 10~20 torr까지 증가시킨다. 세균을 ESEM을 통하여 관찰하였으나 편모와 같은 특징은 잘 해상되지 않았으며 높은 압력에서도 건조는 계속 일어나기 때문에 ESEM은 주로 1000x 배율 이하에서 관찰되는 큰 시료에 대하여 더 유용하다.[8] 앞에서 언급된 방법들은 적절한 시료에 대해서는 우수한 결과를 내지만 최적의 해상도와 넓은 시야가 요구되는 탐지와 특성화 등의 미생물 조사에는 덜 적합하다. 또한 이들 방법은 표준 SEM 장비와 비교할 때 더 복잡하고 전문적이며 field emmision illumi-nation sources 와, 또는 극저온 장비를 장착한 현미경과 같이 비싼 장비를 요구한다. 여기에 기술된 방법은 상대적으로 쉽고 빠르게 진행할 수 있으며 (~15분 정도) 표준 열전도성(thermionic) 텅스텐 필라멘트를 포함하는 SEM을 포함하여 어떤 SEM에도 사용될 수 있는 방법이다. 이 방법은 고정되지 않은 완전 함수성의 시료에 대해서도 적용할 수 있다. 여과는 낮은 초기 입자 농도를 가진 시료에 대한 조사도 가능하게 해준다.
SEM을 위하여 전기 전도성 표면 (electrical conductive surface)을 만들기 위하여 생물학적 시료는 요구되는 초기 탈수 작업 후에 진공 코팅기에서 얇은 막 증발 (thin film evaporation)이나 탄소나 금속 sputtering을 통하여 코팅된다. 이런 코팅 과정은 코팅한 막의 두께 (주로 2~20nm)에 따라 미세한 초구조의 디테일을 흐릴 수도 있다. 이런 기존의 과정은 전형적인 미생물학적 시료에 대해서는 진행하기 어려운데, 이들은 주로 물에 작은 생물학적 입자들이 떠있는 현탁액이기 때문이다 (대부분의 바이러스, 서브마이크로미터 크기의 박테리아, 균류와 기생충의 경우 <100 nm). 추가적인 문제는 환자의 시료나 환경 샘플에서는 관심있는 미생물이 낮은 농도에 존재하여 이들을 표면에서 관찰하기에 어렵다는 것이다.
이 보고서에 우리는 사전에 코팅된 필터 기판에 SEM 관찰을 위한 미생물 현탁액을 농축시키는 방법을 설명한다. 우리는 sputter coating을 하기보다 물에 희석한 ionic liquid (1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate)이 빠르게 미생물학적 SEM 샘플에 침투하여 시료가 charging하는 것을 막아 미생물학 시료에서 좋은 결과를 얻을 수 있도록 해주는 전자 투명 전도성 표면 (electron-lucent conductive surface)을 형성하는데 사용될 수 있다는 것을 보인다 (Fig. 1). Ionic liquid는 전도성이 강한 염으로 상온에서 액체 상태를 유지하고 무시해도 될 정도의 수증기압 ($\leq 5 \times 10^{-9}$Torr)을 가진다. 최신 SEM의 강한 진공 조건 ($\leq 1 \times 10^{-6}$Torr)에서도 ionic liquid는 액체 상태를 유지할 것이며 전도성을 유지하면서도 작동 중 기화하지 않을 것이다.[15][16][17][18][19] 생물학적 SEM에 적용하기 가장 유용한 ionic liquid는 전기 전도도가 대략 $100mScm^{-1}$정도 되며 전기화학적으로 안정하고 ( 약 5.8V의 전기화학적 창 (electrochemical window)를 가지고 있음) 수용성이며 쉽게 합성된다.[16] 이런 성질의 ionic liquid 들이 절연 시료에 대하여 금속이나 탄소 코팅을 한 것과 비슷한 수준의 SEM 이미지 대비를 준다는 것이 이미 입증되었다.[15][20] 이들은 미역, 조직배양세포, 응축된 염색체와 같은 생물학적 시료에 대한 거시적인 이미지화에도 사용되었다.[16][17][18] 인듐-납 산화물 (indium-tin oxide), 알루미늄 호일, 또는 금속 코팅된 커버슬립(coverslip)과 같은 전도성 기판들이 기존의 charging에 사용되었으나[16] 이들 물질은 미생물에 대한 SEM 조사를 위한 여과에 적합하지 않다. 우리는 바이러스나 박테리아 편모와 같은 세포 이하의 물체에 대해서 최적의 결과를 얻으려면 polycarbonate 필터를 알루미늄이나 금으로 코팅하는 것이 필수적이라는 것을 알아냈다. 우리는 ionic liquid staining된 생물학적 시료를 사용할 때 시료 드리프트 (specimen drift)를 탐지하지 못했는데, 이는 초기 여과 과정에서 사용된 conducting membrane에 의하여 잘 지지되었기 때문이다. SPI-porepolycarbonate 필터는 친수성이며 금속 코팅 이후에도 계속 친수성으로 남아 이들을 함수 생물학적 샘플과 작업하기에 이상적인 기판로 만들어주었다. Ionic liquid staining은 생물학적 안전 캐비닛(BSC)에서 진행할 수 있으며 이는 감염성 샘플에 대해서 sputtering coating에 대해 빠르고 안전한 대안이 될 수 있는데 진공 코팅 장비는 에어로졸을 만들 수 있으며 이는 쉽게 억제되지 않기 때문이다. 우리는 필터 기판을 생물학적 샘플을 적용하기 전에 먼저 금속 코팅하는 것으로 샘플을 농축하는 문제와 charging을 방지하는 문제를 명쾌하게 해결했다(Fig. 2). 샘플을 코팅하는 얇은 막이 없는 관계로 charging을 막기 위하여 ionic liquid의 침투가 동시에 요구된다. 결과는 sputter coating을 한 SEM과 negative staining 기술을 적용한 TEM과 비슷하다 (Figs 1 와 2: 보충 Figs S1~S5). 초-여과 (Ultra filtration)는 생물학적 샘플에 존재하는 바이러스나 세균의 디테일을 흐릴 수 있는 잔해를 제거하는데 도움을 주기 때문에 중요하다. 본 보고서에서는 기존에 탈수와 sputter coating을 해야만 얻을 수 있었던 바이러스나 세균 편모의 뚜렷한 이미지를 코팅하지 않은 SEM 시료를 통해 얻음으로써 코팅하지 않아도 뚜렷한 이미지를 얻을 수 있음을 입증하였고, 따라서 SEM으로 조사될 수 있는 미생물 샘플의 범위와 이미지의 해상도를 확대할 수 있었다.
Ionic liquid staining된 박테리아의 이미지는 탈수되어 sputter coating 된 것들보다 더 부드러운 표면 형태를 보였다. 크기 비교를 통하여 탈수된 시료가 대략 10~20% 정도 수축했다는 것을 확인할 수 있었다 (Table 1). 우리는 탈수되어 sputter coating된 박테리아의 표면 디테일을 체내에 존재하는 추가적인 특징의 관찰이 아닌 세포벽 수축에 의한 주름으로 해석한다. 이런 주름은 따라서 건조로 인한 인위적인 구조일 것이다. 박테리아 편모 역시 전도성 기판에 ionic liquid 처리에서도 뚜렷하게 확인되었다 (Fig. 1. 보충 Fig. S3). 이런 결과들은 SEM-sputtered coating과 TEM-negative staining에서 우리가 관찰하였던 것과 비슷했다.
Ionic liquid 기법은 생물학적으로 억제된 SEM enclosure 안의 감염성 병원체에 대해서도 안전하게 사용될 수 있어 기존의 샘플 준비 기법에 비하여 새로운 감염성 인자를 그들의 "본연의 상태"인 함수성 조건에 더 가까운 상태에서 특성화할 수 있다.[4] 본 조사의 경우 우리의 기존 프로토콜은 에탄올 series의 탈수와 이에 뒤따르는 공기 건조와 SEM 이미지화 이전의 금속 코팅이 포함되었다. ionic liquid 프로토콜에서 생물학적 샘플에 한 방울의 2.5% 수용액 상태의 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate이 바로 위에 놓여졌다. 넘친 액체를 제거하기 위하여 닦아낸 후 젖은 샘플은 곧바로 SEM에 넣어진다. 감염성 샘플을 취급한다면 관습적인 과정에서는 sputter coating process 중 감염성 에어로졸의 발생 위험을 줄이기 위하여 알데하이드(aldehyde) 고정 과정이 추가적으로 필요하다. 이 고정 단계는 ionic liquid technique에서는 요구되지 않는데, 샘플이 생물학적 억제 후드 (biological containment hood)에서 가공되며 유기물의 자연에 가까운 상태를 위하여 고정되지 않고 함수 상태로 생물학적으로 억제된 SEM enclosure에 곧바로 들어가기 때문이다.[4] 현미경은 새로운, 또는 변종 균주를 놓칠 수 있었던 기존의 진단 검사를 보완하고 빠르게 존재하는 유기물의 종류를 확인하여 더 특징적인 검사를 고를 수 있도록 도와준다. 그러나 전자 현미경은 미생물의 신뢰성 있는 식별을 위하여 최소 입자 농도를 필요로 한다. 바이러스의 경우 $10^5~10^6$ 바이러스 입자/mL 이다. 여과 기법을 이용하면 TEM과 SEM 모두에서 5000입자/샘플 정도에서도 가능하다.[3]
미리 코팅된 필터에서의 Ionic liquid staining은 넓은 범위의 생물학적 샘플에 대해서도 적용 가능하며 관심있는 입자를 여과하고 농축하는데 도움이 된다. 두 종류 이상의 금속이 각각 다른 부위에 코팅된 필터를 사용하면 어느 금속 코팅이 특정 시료나 그 특징을 관찰하는데 있어 최적의 결과를 주는지 알 수 있어 시간을 아낄 수 있다 (Fig. 2a,e~k). 그 예시로 기판의 Al-코팅된 영역에서는 ionic liquid staining 세균 편모가 더 밝게 나타났지만 필터의 Au-코팅된 영역에서는 그 대비가 바뀌어 편모는 더 어둡게 나타났다 (Fig. 2h~k). 유사하게 에볼라 바이러스와 Leptospira biflexa의 이미지는 알루미늄 코팅된 필터에서는 우수한 수준의 표면 디테일을 보였던 반면 금 코팅된 필터에서는 디테일이 적었으며 어둡고 평평한 실루엣으로 나타났다 (보충 Figs S4, S5). 우리는 이것이 Al보다 더 높은 Au의 이차 전자 방출 신호 때문이라고 제안한다. 본 조사에서 우리는 생물학적 시료를 이미지화하는데 가장 일반적으로 쓰이는 이차 전자 감지기를 통하여 SEM 이미지를 얻었다. SEM에서 이차 전자 방출 계수 ($\delta$)는 원자 번호에 무관하게 상대적으로 일정하다. 그러나 Au에서 예외가 생기는데, Au의 $\delta$ 값이 Al이나 다른 원소들의 거의 두 배이다. $\delta$ 값은 빔의 에너지에도 영향을 받는데, 20 kV에서 $\delta$ 값은 Al에서 0.1이고 Au에서 0.2이다. 동일한 이미지에서 4 kV로 Al과 Au 모두를 사용하여 찍은 이차 전자 이미지의 강도를 측정함으로써 우리는 Au의 신호 강도가 Al의 2.1배였다는 것을 계산하였다. 금으로 코팅된 필터에서 시료를 기록한 이미지를 바탕으로 우리는 배경 기판과 너무 큰 대비를 일으켜 편모와 같은 부분을 밝은 배경에 "실루엣"과 같이 나타나게 하는 등 미세한 디테일을 가리는 경향이 있다고 위 결과를 해석했다. 그러나 ionic liquid가 침투한 미생물, 그리고 알루미늄 코팅된 필터는 비슷한 방출 계소를 가지고 있어 재료 구성으로 인한 차이보다는 표면 구조의 차이로 인한 대비가 커서 미세한 디테일도 잘 포착될 수 있게 한다.
필터를 금속으로 미리 코팅하는 것은 구멍 크기와 필터의 여과 능력에 영향을 주지 않았다 (Fig. 2). Ionic liquid staining 프로토콜은 표준 랩 벤치에서 15분 정도에 전체를 끝낼 수 있으며 생물 안전성 캐비넷에서 하는 것이 좋다 (Fig. 2c, d). SEM의 sputter coating 기법에서 너무 얇은 표층은 전도와 전하를 얻는 것이 불량한 반면 너무 두꺼운 표층은 미세한 디테일을 얻기 힘들게 한다. 필터 구멍이 막히지 않는다면 기판을 미리 코팅할 때의 두께는 생물학적 시료에서 전형적으로 사용되는 sputter coating의 두께보다 훨씬 커도 된다 (Fig. 2e~k, 보충 Fig. S2).
본 조사에서 우리는 Al과 Au로 각각 18, 27nm 의 코팅을 하였다. 이는 위의 두께가 코팅되지 않은 필터에 비하여 charging을 막는데 충분한 것으로 확인되었기 때문이다 (보충 Fig. S2). 이런 최소 두께의 기판은 반짝거리는 금속 코팅으로 보였기 때문에 쉽게 구별할 수 있었다. 만약 Au에서 27nm 미만이거나 Al에서 18nm 미만의 코팅이 존재한다면 이들은 불투명하거나 납작하고 흰 모습을 가지고 있을 것이다 (Fig 2). 금속 코팅된 필터를 이용한 ionic liquid staining을 통하여 우리는 20nm의 지름에 불과한 Salmonella의 편모를 비롯한 세균의 미세한 구조적 디테일을 SEM으로 시각화할 수 있었다. (Fig. 2j,k, 보충 Fig. S3)
여과와 단순한 ionic liquid 침투를 통하여 얻은 SEM 결과는 관습적인 SEM의 sputter coating 방법과 TEM의 negative staining 방법과 Leptospira, Salmonella와 같은 다양한 세균과 vaccinia 바이러스, 에볼라 바이러스 등 다양한 바이러스 시료에 대해서 비슷한 퀄리티의 이미지를 얻을 수 있었다.[3][12][21] (Fig. 1, 보충 Fig. S3~S5) 우리는 ionic liquid가 침투한 세균과 바이러스 SEM 이미지가 탈수 sputter coating된 SEM과 negative staining된 TEM 이미지와 비교했을 때 훨씬 적은 수축을 보였다는 것을 발견했다 (Table 1). 모든 경우에 미생물의 탈수 sputter coating 처리된 SEM 이미지와 negatie staining된 TEM 이미지에서 ionic liquid가 처리된 시료보다 9.9%~18.9% 크기가 수축했다 (Table 1). 지난 조사에서 우리는 동결-유리화 (frozen vitrified) 에볼라 바이러스를 극저온 전자 현미경으로 이미지화했으며 이때 에볼라 바이러스의 지름은 약 96~98nm[12] 로 본 연구에서 같은 시료에 대해 ionic liquid를 처리하여 측정한 지름 값인 98.5$\pm$10.2nm와 매우 유사하다. 이는 샘플로 침투한 ionic liquid의 부피가 함수상태에서 언 부피와 비슷하다는 것을 보여주며 이는 완전 함수의 자연 상태 에볼라 바이러스에 가깝다는 것을 보여준다. 막대 모양 구조에서 10% 크기의 감소는 탈수로 인한 27% 정도의 부피 감소와 동일하지만 원통형 모양의 평탄화와 붕괴는 훨씬 더 큰 물 손실을 의미한다. sputter coating된 바이러스와 세균에서 탈수로 인한 평탄화와 붕괴가 어느 정도 있다는 것은 분명하다 (Fig. 1).
비록 이미지가 상대적으로 비슷하기는 하지만 금으로 sputter coating된 것이 ionic liquid보다 약간 더 대비를 주는 것으로 확인되었다. 또 다른 의식할만한 변화는 ionic liquid staining된 이미지에서 세균 세포벽에서의 표면 거칠기가 더 적다는 것이다. 이는 Salmonella의 이미지에서 확인할 수 있다 (Fig. 1. 보충 Fig. S3). sputter coating된 세균 세포의 표면에는 선명한 질감과 주름진 모습이 있는 반면 ionic liquid를 침투시킨 경우 매끄러운 세포벽 모습이 있었다. 우리는 이러한 차이가 sputter coating된 시료에서의 탈수와 부피 손실로 인한 세포 팽압 손실의 결과라고 제안하며 따라서 주름은 탈수에 의하여 강조된 특징이나 혹은 인공 구조일 것이다. 이를 뒷받침하는 증거는 다른 편모와 같은 미세한 구조들은 sputte coating된 시료와 ionic liquid 처리된 시료에서 비슷한 모습으로 뚜렷하게 확인된다는 점이다. 따라서 세균에 sputter coating을 사용한 이전의 연구들은 가능한 탈수 효과를 고려하여 조심스래 재해석되어야 할 것이다.
본 조사에서 제시한 ionic liquid 과정은 시료 필터가 더 발전된 기술로 준비될 수 있기 때문에 빠르고 재현 가능하다. Ionic liquid가 매우 낮은 증기압을 가지고 있기 때문에 SEM을 관찰할 때 시료가 마르면서 수축이나 주름, 또는 금이 가는 현상 등을 피할 수 있다 (Table 1, 보충 Fig. S3). 향후 우리는 나노미터 크기 범위의 생물학적 시료에 대해 ionic liquid staining하는 SEM 기술을 발전시키기 위한 다양한 유형의 필터 코팅의 개발을 기대한다.
방법
세균의 생장, Salmonella의 Senftenberg (국립 미생물 연구소의 George Golding 박사가 친절하게 제공해주신) 균주를 3mL LB broth에서 37℃에서 shaking을 하면서 오버나잇으로 길렀다. 박테리아 50$\mu L$이 3mL LB broth에 37℃에서 shaking을 하면서 4시간 동안 적절한 mid-log phase로 이차 배양되었다. 박테리아는 1:1 v/v로 1% paraformaldehyde와 2% gluteraldehyde에서 1시간동안 실온에서 고정되었다. Leptospira biflexa의 serovar Patoc (국립 미생물 연구소의 Robbin Lindsay 박사가 친절하게 제공해주신) 균주를 Ellinghausen and McCullough media modified by Johnson and Harris (EMJH) (네덜란드의 Royal Tropical Institute)에서 키웠다. Inoculate culture는 14일간 30℃에 놓였으며 낮은 조도에서 실온에 보관되었다.
Modified vaccinia Ankara 바이러스의 성장과 정제, 아기 햄스터의 신장 섬유아세포 (BHK-21:ATCC)는 10% fetal bovine serum과 1X Penicillin-Streptomycin이 보충된 high-glucose DBulbecco's Modified Eagle's Medium에서 80% confluence로 길렀다. BHK-21 세포는 1mL의 Modified vaccinia Ankara (MVA) 바이러스 (국립 미생물 연구소 Jingxin Cao 박사가 친절하게 제공해주신)에 의하여 감염되었으며 48시간 동안 37℃에서 5%의 CO2 조건으로 배양되었다. 감염된 세포는 growth media에서 -80℃와 상온 사이의 3번의 동결-융해 (freeze-thaw) 사이클을 겪었다. MVA는 3000g에서 3분간의 원심분리 이후 세포와 잔해를 치운 다음 상층액에서 수집하였다.
에볼라 바이러스의 성장과 정제, 자이르 에볼라 바이러스 (Zaire Eblo virus) (Steven Jones 박사가 친절하게 제공해주신)를 [12][22]의 방식으로 번식, 정제하였고 비감염성으로 만들었다.
SEM 이미지화를 위한 금으로 코팅된 샘플 준비, 별다른 말이 없다면 샘플 준비는 class II 생물학적 안전 캐비닛에서 진행되었다. 모든 샘플은 13mm Swinnex filter unit (Millipore, Billerica, MA, USA) 안에 있는 SPI-pore polycarbonate track etch filter (SPI Supplies, West Chester, PA, USA)을 통과하였다. 세균 샘플 준비를 위하여 0.08$\mu m$ pore size filter가 사용되었으며 MVA와 에볼라 바이러스 준비에는 0.05$\mu m$ pore size filter가 사용되었다. 필터는 우선 2mL Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)로 3mL Luer-Lok syring에서 적셔졌다. 샘플을 필터 위에 장착하기 위하여 샘플 100$\mu L$가 5mL 주사기 안의 5mL DPBS에 첨가되었다. 주사기를 filter holder에 부착한 후에 샘플은 Legato 200 syringe pump (KD scientific, Holliston, MA, USA)를 사용한 필터를 통하여 1000$\mu L$/min의 속도로 여과되었다. 가끔 샘플의 농도가 너무 높아 필터에 과부하가 걸려 유체가 빠저 나가지 못하는 경우가 있었다. 이런 상황이 일어났다면 샘플은 1:5 또는 1:10으로 희석되어 유체가 필터를 자유롭게 빠져나갈 수 있도록 하였다. 2mL의 에탄올, 차례대로 50%, 70%, 85%, 95%, 100%는 각각 순서대로 3mL 주사기를 통하여 샘플 필터를 세척하였다. 마지막 세척 후 필터는 필터 유닛에서 분리되어 공기 중에서 30분간 건조했다. 필터는 반으로 가르고 다듬어 9mm carbon disc (SPI Supplies)에 놓고 3/8" aluminum stub (SPI Supplies)에 장착했다. 필터의 네 코너에 Flash Dry silver paint (SPI Supplies)가 사용되어 filter와 stub 사이의 접촉을 만들었다. 샘플은 생물 안전성 캐비넷 밖으로 꺼내져 0.1mm 금 타겟을 포함하는 Quorum Q150R S (Quorum Technologies, East Sussex, UK)를 이용하여 금으로 sputtered되었다. 샘플은 pumped down, purged with argon, 그리고 120초간 rotating stage에서 금으로 sputtered되었다.
금속 코팅된 Polycarbonate 필터 준비, 한 종류의 금속으로 코팅되는 필터를 준비하기 위하여 다음 과정이 이용되었다. (보충 Fig. S1a). Forts step을 위해서는 0.2mm 직경의 Al 와이어 2cm나 0.2mm 직경의 Au 와이어 3cm를 텅스텐 필라멘트 주위에 감았다. SPI-pore polycarbonate track etch filter는 유리 접시의 필터 용지에 올려지고 금속 와셔로 움직이지 않도록 고정되었다. 이후 접시는 Turbo Carbon Coater (Agar Scientific Ltd, Stansted, Essex, United Kingdom) 안에 놓였다. 진공 상태에서 Al 또는 Au 와이어가 완전히 증발할 때까지 전압은 서서히 높혀졌다. 2cm의 알루미늄 와이어는 18nm 두께 정도의 금속 필름을 형성할 것이며 3cm의 금 와이어는 27nm 두께의 금속 필름을 형성할 것이다. 두 종류의 금속이 있는 필터를 만들기 위해서는 위쪽과 같은 과정의 변형이 사용되었다 (보충 Fig. S1b). 필터는 유리 접시의 필터 용지 위에 올려진 후 면도날이 필터의 절반을 가린다. Au와 Al 중 하나의 금속이 위와 같은 과정으로 증발된다. 이후 기존의 면도날이 제거되고 두번째 면도날이 금속이 붙은 절반 부분을 가리면 필터의 나머지 부분은 다음 금속으로 코팅된다.
SEM 이미지화를 위한 Ionic Liquid 샘플 준비, Ionic liquid인 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate가 증류수에 2.5%의 최종 농도로 희석된 후 점도를 줄이기 위하여 30분간 40℃에 놓는다.[5] 금속으로 코팅된 필터는 필터 유닛 안에 놓여져 2mL DPBS를 통해 적신다. 총 100$\mu L$의 샘플이 5mL의 DPBS에 첨가되어 Legato filter pump을 이용하여 코팅된 필터를 통하여 여과된다. 샘플이 5mL의 증류수에 의하여 씻긴 후 필터는 filter 조립체에서 분리되며 넘친 액체는 티슈 페이퍼를 이용하여 제거하였다. 필터는 곧바로 다듬어져 aluminum stub에 장착된 carbon disc 위에 놓였다. 필터의 네 모서리는 aluminium stub에 Flash Dry silver paint를 이용하여 painted 되었다 (The four corners of the filter were painted to the aluminium stub using Flash Dry silver paint). 총 50$\mu L$의 ionic liquid가 피펫으로 샘플 위로 옮겨졌고 넘치는 양은 60초 후 필터 용지로 닦아내었다. 샘플은 이후 SEM으로 관찰하였다.
SEM을 이용한 샘플 이미지화, 모든 샘플은 이동식 생물학적 containment enclosure (Dycor Technologies Ltd. Edmonton, AB, Canada) 안에 들어있는 JCM-5700 주사 전자 현미경 (JEOL, USA, Peabody, MA, USA)에서 이미지화되었다.[4] 금으로 코팅된 시료는 8mm의 working distance와 30$\mu m$의 대물렌즈 구멍 (aperture)으로 6kV의 높은 진공 상태에서 이미지화 되었다. 이미지는 이차 전자 검출기를 이용하여 얻었으며 이미지 당 획득 시간은 160초였고 각 이미지는 2560$\times$1920 픽셀이었다. Ionic liquid staining된 샘플에 대한 이미지는 위의 세팅과 가동 전압이 4kV로 조절되었다는 예외를 제외하면 동일한 세팅으로 얻었다. SEM 이미지는 3,000x 부터 20,000x까지의 배율로 녹화되었다.
TEM 샘플 준비 및 이미지화, 샘플은 탄소 코팅된 400-mesh copper grid의 formvar film에 1분간 흡착되었다. 흡착된 샘플은 증류수에서 3X 세척되었으며 2% methylamine tungstate (Nano-W; Nanoprobes, Yaphank, NY, USA)에서 negatively contrasted 되었다. 이미지화는 200kV에서 FEI Tecnai 20 투과 전자 현미경 (FEI Company, Hillsboro, OR, USA)를 이용하여 진행되었다. 시료의 디지털 이미지는 AMT Advantage XR 12 CCD camera (AMT, Danvers, MA, USA)을 사용하여 얻었다. TEM 이미지는 3,500x부터 19,000x까지의 배율로 녹화되었다.
이미지 처리 : 길이 측정, 에볼라 바이러스, Salmonella Senftenberg, 그리고 Leptospira biflexa의 지름 측정은 Image J software package의 straight line tool과 analyze/measure function을 이용하여 진행되었다.[23] 측정된 길이는 이미지의 scale bar와 Image J의 analyze/set scale function을 이용하여 환산하였다. 본 분석에서 세균과 바이러스의 길이는 다양하지만 상대적으로 일정한 지름을 가진 경우에만 지름을 측정하였다. 측정 결과는 수집하여 MS Excel을 이용하여 분석하였다.
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